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多克隆抗体制备服务（宿主：羊）

本项目利用抗原免疫1只波尔山羊，取得抗原高效价羊抗血清，制备抗原亲和纯化柱，纯化取得相应的抗体。

阶段一（M1）：动物免疫与抗血清筛选验证

1.项目目标

将对应的抗原，用于动物免疫及抗血清纯化实验，完成动物免疫，建立抗血清的筛选验证方法，完成羊抗血清效价评估，做出GO/NO-go决定。

2.实验材料与主要仪器

实验材料与主要仪器
实验材料
抗原蛋白	波尔山羊	弗氏佐剂（购自Sigma）	二抗：兔抗羊-HRP（南京z6com人生就是博生物）
其它试剂均为国产分析纯
主要仪器
台式高速冷冻离心机（湖南安君研）	pH计（上海雷磁）	分析电子天平（常州市幸运电子）	电热恒温培养箱 （天津市泰斯特）
酶标仪（北京普朗医疗）	洗板仪（北京普天新桥）	超净工作台（中国苏净集团）	HD-2核酸蛋白检测仪（南大普阳）

3.实验方法和操作步骤

3.1 动物免疫

使用抗原蛋白免疫1只波尔山羊，动物编号为XXX，每只皮下免疫0.5-1 mg /次，2周免疫1次，免疫4-5次。

具体免疫流程如下：

项 目	说 明
动 物	波尔山羊
佐 剂	Sigma完全弗氏佐剂（CFA）和Sigma不完全弗氏佐剂（IFA）。
免疫原	每次免疫抗原使用量注射每次0.5-1 mg/只。
免疫方法	免疫原和免疫佐剂以1:1的比例充分混合乳化，制成稳定“油包水”液体；皮下多点注射。
免疫流程	免疫前采血	采血（免疫前血清）
	第一次免疫	完全弗氏佐剂（1 mg/只 ）
	第二次免疫	不完全弗氏佐剂（0.5 mg/只 ）
	第三次免疫	不完全弗氏佐剂（0.5 mg/只 ）,采集1 mL血清效价检测。
	第四次免疫	不完全弗氏佐剂（0.5 mg/只 ）,采集1 mL血清效价检测。
	第五次免疫	不完全弗氏佐剂（0.5mg/只 ）,采集1 mL血清效价检测。
	终放血	颈动脉放血。

3.2 抗血清效价检测

顺利获得间接ELISA检测抗血清效价，具体间接ELISA步骤如下：

（1）用PBS包被液将抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 μL，4℃冰箱过夜。 包被抗原：抗原
包被浓度：5 μg/mL，100 μL/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4)

（2）包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

（3）抗血清按1:500，3倍稀释，每孔100 μL，37℃恒温箱1 h。

（4）取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀释好的酶标二抗，酶标二抗：兔抗羊-HRP，1:50,000。37℃恒温箱1 h。

（5） 取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100 μL TMB显色液， 37 ℃，15 min。

（6） 每孔加入100 μL 1 M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450 nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

血清效价如图1：

图1: 动物5免后血清间接ELISA效价检测结果

4. 实验结果

本项目共免疫1只波尔山羊，经过4-5次免疫后产生良好免疫反应，根据结果分析，已完成抗血清效价评估及抗血清制备实验，共取得1L抗血清。下一阶段将进行纯化实验。

阶段二（M2）：多克隆抗体的亲和纯化

5.项目目标

抗原亲和纯化取得特异性多克隆抗体。

6. 实验材料与主要仪器

实验材料与主要仪器
实验材料
抗原蛋白	琼脂糖介质（GE）	Acr、Bis、Tris（购自Sigma）	二抗：兔抗羊-HRP（南京z6com人生就是博生物）
0.22 μm无菌滤器（购自Millipore）	透析袋（索莱宝）
其它试剂均为国产分析纯
主要仪器
台式高速冷冻离心机（湖南安君研）	pH计（上海雷磁）	分析电子天平（常州市幸运电子）	电热恒温培养箱 （天津市泰斯特）
酶标仪（北京普朗医疗）	洗板仪（北京普天新桥）	超净工作台（中国苏净集团）	HD-2核酸蛋白检测仪（南大普阳）

7.实验方法和操作步骤

7.1 抗血清纯化

将抗原分别与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，用10倍胶体积的PBS过柱，平衡亲和柱；取出加入待纯化血清样品稀释液，恒流泵循环反复上样；上样结束后用10倍胶体积的PBS再次平衡亲和柱，洗出未与胶结合的杂蛋白，待层析柱中的PBS流尽后加入洗脱液，根据仪器显示峰值变化，开始进行洗脱液收集；洗脱完成后，向收集的抗体中加入一定量的中和Buffer以中和洗脱的抗体；洗脱结束后用20倍胶体积PBS平衡亲和柱；洗脱的抗体用至少200倍抗体体积的PBS pH7.4 buffer进行透析，4℃透析过夜，换液2-3次；次日取出透析后的抗体，根据收集的抗体体积，加Proclin300至终浓度为0.5‰，并检测抗体浓度，实行相应记录。

7.2 纯化鉴定

隔日进行纯度，浓度和效价测定，顺利获得ELISA检测抗体的效价，用BCA浓度测定试剂盒对抗体进行浓度测定、用SDS-PAGE电泳方法对抗体纯度进行鉴定。

7.3 纯化抗体间接ELISA效价检测，具体步骤详见3.2。

8. 实验结果

8.1纯化抗体效价检测如下:

表1 纯化抗体的检测结果
编号	Dilution	A450 nm
		纯化抗体
1	500	4.000
2	1,500	3.687
3	4,500	3.386
4	13,500	3.386
5	40,500	3.386
6	121,500	3.210
7	364,500	2.054
8	1,093,500	0.882
9	3,280,500	0.491
10	9,841,500	0.231
11	29,524,500	0.160
12	空白	0.137
13	Titer:	＞3,280,500

起始稀释度：1:500
效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度

8.2 纯度鉴定

对纯化取得的抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色鉴定，可见抗体纯度在85%以上。

图3纯化抗体SDS-PAGE分析
M:蛋白质分子量标准
1:纯化抗体分析结果

 

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