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1.简述

  GST纯化系统是利用GST（glutathione-S-transferase）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）顺利获得二硫键共价亲和，顺利获得GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。该纯化柱中，凝胶手臂上顺利获得硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽疏基转移酶（即GST-tag（26KD））之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。谷胱甘肽通常有氧化性GSSG和还原型GSH，当我们使用GSH洗脱时，GSH会与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。

2.实验试剂

表1 缓冲液及配方
GST纯化缓冲液	配方
Lysis Buffer	1×PBS;pH 7.4
Elution Buffer 1	1×PBS;50mM GSH;Ph 7.4

 

3.具体纯化步骤：

（1）收菌，每克菌加入10ml-15ml的非变性裂解液Lysis Buffer:1×PBS；pH7.4（非变性裂解液的选择：根据具体蛋白等电点PI值，选择合适的Buffer，在非变性裂解液中加入1%TritonX-100,2mM/ml PMSF, ）重悬。(全程冰浴)

（2）超声破碎，把混合非变性裂解液的菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3s，间隔6s.超声5-10Min。（超声完全的判断：溶液中有无块状物，溶液是否粘稠。）

（3）将破碎液用离心机离心12000r/min，4℃，30min，取上清，此条件可重复两遍，然后把上清和沉淀分别留样，坐上清纯化。

（4）取GST柱，清洗干净柱子，加入2-3ml GST柱（可根据具体GST的说明书选择合适的量），用非变性裂解液Lysis Buffer平衡柱子5-10倍柱体积。

（5）为了让柱子和上清充分结合，放置在旋转孵育器上孵育2-4h后取出纯化，整个孵育过程在4℃的层析柜中进行。

（6）孵育结束后，将孵育好的蛋白过柱，流出取样。

（7）用非变性裂解液Lysis Buffer洗去未吸附的样品，流速1-3ml/min，直到洗脱至流出液的紫外检测仪数值不在变化为止。

（8）用Elution Buffer 1洗涤蛋白至紫外检测仪数值趋于稳定，流速1-2ml/ml，收集样品，2ml/管收集。

（9）将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白，取样，跑SDS-PAGE。

（10）根据SDS-PAGE电泳图，分析进行下一步实验。

4.GST柱的回收

（1）取待再生的GST柱，将其倒入空层析柱中。

（2）加入DDH2O冲洗柱子，冲洗5-10倍柱体积，流速1-2ml/ml。

（3）加入（50mM Tris,150mM NaCl,6M 盐酸胍，pH8.0）清洗柱子，冲洗5-10倍柱体积，流速1-2ml/ml。

（4）加入DDH2O冲洗柱子，冲洗5-10倍柱体积，流速1-2ml/ml。

（5）取少量柱子制样跑胶，若无条带，可进行下一步操作。

（6）将柱子储存在20%的乙醇中，放置在4℃层析柜中待用。

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