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    RNA pull-down实验原理/方法/流程

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    RNA pull down原理

        RNA沉降(Pull down)主要是检测蛋白质与RNA之间的相互作用。第一时间把已知序列 的RNA实行标记(例如biotin),依靠这个标记将RNA固定到某珠子(Beads) 上,再和含有蛋白质的物质,例如细胞裂解物共孵育,之后去掉未与RNA作用的上清。收集从珠子上洗下来的蛋白质,如果蛋白质是未知的,则要去作质谱鉴定;如果想知道是不是某蛋白质,则要作Western Blot鉴定。


    基本思路

        研究蛋白质与RNA之间的相互作用,大致有两种思路:①将RNA耦联于珠子以富集与之相互作用的蛋白质;②用蛋白特异的抗体去免疫沉淀蛋白质,再顺利获得提取蛋白复合体中的RNA,利用QT-PCR等方法以检测与之相互作用的RNA。

    1. RNA耦联珠子以富集与之相互作用的蛋白质

      (1)高碘酸盐耦联法
      ①RNA-高碘酸盐反应。
      a.配制以下反应体系。
      500 pmol RNA (100 个碱基的RNA 15μg,25个碱基的RNA4μg)
      40μL 1mol/L CH3COONa pH=5.0
      20μL 0.1mol/L高碘酸盐(溶于水且新鲜配制)
      补水至400pL。
       b.室温,置于旋转仪上孵育1h (反应管外包裏铝箔纸)。
       c.加80μL 1mol/L CH3COONa (pH=5.0),再加1mL 100%无水乙醇,-20°C,静置1h。在此期间,开始准备珠子。
      d. 4℃,12000r/min, 10min, 70%乙醇洗一次后干燥;将干燥好的RNA沉淀用100μL CH3COONa (0.1mol/L)重悬。
      ②准备珠子。
      a.将100μL乙二酸去异烟肼琼脂糖珠(含50%上清)在10mL离心管中洗涤,10mL0.1mol/L CH3COONa (pH5.0)洗3次,每次4℃,3000r/min, 5min,弃上清。
      b.用200μL 0.1 molyE CH3COONa (pH=5.0)重悬样品。
      ③RNA-珠子结合反应。
      a.将之前准备好的300μL珠子加入高碘酸盐处理好的RNA中。
      b.4℃置于旋转仪上避光结合过夜(反应管外包裹铝箔纸)。
      c.4℃, 3000r/min, 5min,去上清,用1mL 2mol/L NaCl洗2次,然后将样品移至1.5mLEP管,4℃,3000r/min, 5min, 弃上清。
       ④接下来,可选方案1或方案2。
      方案1如下。

      a.洗RNA结合的珠子。
    •用1mlL缓冲液D洗3次,4C,3000r/min, 5min,弃上清。
    •100μL缓冲液D重悬。

    缓冲液D配方:20ml 40μL HEPES
    2mL KCI
    4μL EDTA
    20μL DTT
    1.2mL 甘油
    20μL 酶抑制剂

    b. RNA-Protein 结合反应。
    •准备500μL RNA样品反应体系。
    300μL缓冲液D
    100μL目的蛋白(10-15μg/μL)
    肝素(100μg/μL 储存液稀释至终浓度0.5-2.5~5.0μg/μL)
    加酶抑制剂,按1:1000加。
    补水至500μL。
    •摇晃混匀。
    •旋转仪上孵育4h (4C)。
    •4°C, 3000r/min, 5min, 尽可能弃去上清。
    •1mL缓冲液D洗3次,每次置于旋转仪上5min,去上清。
    •加入50μL 2 X SDS.上样缓冲液,煮样10min,行Western Blot。
    a.洗RNA结合的Beads
    •用1.0mL缓冲液B,4°C 3000r/min, 5min,弃上清。
    •100μL 缓冲液B重悬。

    缓冲液B配方: 5mmol/L HEPES pH 7.9
    1 mmol/L MgCI2
    0.8mmol/L 乙酸镁

    b. RNA-蛋白质结合反应。

    •准备500μL RNA样品反应体系。

    50μL 10X结合缓冲液。

    100μL目的蛋白(10-15μg/μL)

    100μL结合了RNA的珠子

    肝素(100μg/μL 储存液稀释至终浓度0.5-2.5~5.0μg/μL)加酶抑制剂,按1:1000加。

    补水至500μL。

    轻轻摇晃离心管,于旋转仪上孵育30min,室温。

    •4℃,3000r/min,5min,尽可能弃去未结合的蛋白混合物。

    •Buffer B洗5次(1mL),4℃, 3000r/min, 5min,弃上清。

    •加人50μL 2XSDS上样缓冲液,煮样,行Western Blot。

    2.生物素-磁珠耦联法

    (1)实验原理

        使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链酶亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,顺利获得Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

    (2)需要的试剂

    亮抑酶酞,抑酶酞,胃酶抑素,HEPES等

    (3)实验步骤

    ①胞浆蛋白提取。100mm培养皿(6X106细胞),去培养基→PBS洗2次→沉淀用0.5mL胰蛋白酶消化加人PBS 2mL,反复吹打收集细胞,转移至EP管,3000r/ min离心2min,弃上清,PBS重复洗1次。加人100μL缓冲液A,吸打混匀,冰浴15min。 加人缓冲液A (含2.5% NP40) 12. 5μL,轻缓颠倒混匀6次,4°C,4000r/min离心5min,上 清用于胞浆蛋白分析。

    ②探针标记。Promega 试剂盒,Maxiscript T7 Kit, # 1312。

    a.205mmol/NTP Mix。

    b.体外转录反应。

    c.探针纯化。

    ③沉降。

    a.珠子处理。

    b.Pull-down

    c.煮样,行Western Blot。

    3.顺利获得免疫沉淀蛋白以富集与之相互作用的RNA

    (1)6盘10cm皿已经长满的细胞。

    (2)DEPC处理的PBS洗3遍,10mL/遍。最后用4mL PBS刮下细胞,并将细胞吹散。

    (3)将细胞转移至5mL离心管中,2000r/min 离心5min,弃上清。

    (4)加人2mL (根据细胞量确定)免疫共沉淀缓冲液,吹匀细胞。冰上裂解20~30min,期间用1mL枪和2.5mL注射器将细胞裂解液吹散,使反应充分进行。

    (5)将细胞裂解液转移至2个2mLEP管中,12000r/min最高转速离心20min离心后取上清。

    (6)开始准备protein A/G珠子,取100pL珠子于1.5mL EP管中。用免疫共沉淀buffer洗3遍,再加人100μL免疫共沉淀缓冲液,将珠子均匀悬浮其中。

    (7)将准备好的beads与第(5) 步中的上清混合,4C旋转1h。

    (8)离心后,吸出液体,将液体平均分到2个EP管中,分别加入4μg抗体和NormalIgG,并都加入2μL RNase抑制剂,混匀,4℃,旋转过夜。

    (9)准备100μL珠子,方法同(6),加入5μL RNase抑制剂(可选)。

    (10)将(9)中的珠子每管加入26μL。4°C反应L5h。

    (11) 用免疫共沉淀缓冲液洗珠子,洗5遍。

    (12) Trizol提取RNA。

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