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抗生素抗性基因检测实验操作步骤

本文以客户的案例为背景，介绍了实时荧光定量PCR法检测抗生素抗性基因的所需的试剂耗材以及详细的实验操作步骤。

实验摘要

以目的DNA为模板，PCR扩增取得目的片段，进行TA克隆。提取质粒，单酶切线性化，进行梯度稀释取得一系列不同浓度的标准品。顺利获得实时荧光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，对样品进行绝对定量。

1.试剂与耗材

试剂与耗材
样品：45例土壤样品。	胶回收试剂盒，美国Axygen公司，AP-GX-50。
2×Taq PCR MasterMix，南京z6com人生就是博生物技术有限公司，PC16-1。	SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒，北京艾德莱，DN27。
SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），Bµlk，宝生物工程（大连）有限公司，RR820L。	Hind III，宝生物工程（大连）有限公司，1060A。
EcoR I，宝生物工程（大连）有限公司，1040A。	pMDTM19-T Vector Cloning Kit，宝生物工程（大连）有限公司，6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit，北京艾德莱生物有限公司，CV1401。	DL2000 DNA Plus Marker（100、250、500、750、1000、1500、2000 bp），南京诺唯赞生物技术有限公司，MD101。
1Kb DNA Ladder Marker（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 kb），南京诺唯赞生物技术有限公司，MD105-01。	GelStain，北京全式金生物技术有限公司，GS101-01。
Agarose，西班牙Biowest公司，91622。	离心管，美国Axygen公司，311-01-051。
枪头，美国Axygen公司。	其它试剂均为国产分析纯。

2.主要实验仪器

主要实验仪器
荧光定量PCR仪，杭州BIOER，Lightcycle K。	基因扩增梯度PCR仪，杭州博日，TC-96/G/H(b)C。
台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司，Allegra 21R。	电子天平，美国AHOMS公司，AR5120。
恒温水浴锅，美国Amersham Pharmacia公司，MultiTemp III。	紫外透射仪，美国Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25。
雪花状制冰机，日本SANYO公司，SIM-F140AY65。	移液器，德国Eppendorf公司。
单人单面（垂直送风）洁净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司，SJ-CJ-1FD。

3.抗性基因检测实验步骤及结果

3.1.DNA提取

提取步骤参见SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒说明书。

3.2.DNA扩增

PCR反应体系如下：

PCR反应体系如下：

3.3.TA克隆

pMDTM19-T Vector Cloning Kit，宝生物工程（大连）有限公司，6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit，北京艾德莱生物有限公司，CV1401。

（1）将上述PCR产物切胶回收后，在PCR管中配制下列溶液：

（2）室温（20℃-30℃）连接5 min。

（3）取100 µL感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后轻弹几次将细胞均匀悬浮。

（4）加入连接产物，轻轻混匀，室温放置5min。

（5） 向离心管中加入500 µL不含抗生素的LB培养基，混匀。37℃，200 r/min，30 min。

（6）吸取复苏后细菌，均匀涂在含Amp的琼脂培养基上。37℃，倒置待平板吸收全部菌液，过夜培养。

（7）挑取阳性单菌落，PCR检测，并送样测序。

3.4.标准曲线的制作

（1）将阳性菌株，接种到含氨苄抗性的LB培养基中，37℃ 200 r/min，摇菌过夜。

（2）提取质粒，顺利获得单酶切后，回收酶切产物。

（3）测浓度，计算拷贝数，制成标准品。

3.5.荧光定量PCR

反应体系的配制（总体积20 μL）：

荧光定量PCR扩增条件的设置：

扩增曲线：94℃ 30 s；94℃ 10 s，60℃ 12 s，72℃ 30 s循环45次，72℃单点检测信号。

溶解曲线：95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s，陆续在检测信号。

3.6.实验结果

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